형광현미경은 연구자들이 세포와 조직 내의 특정 분자와 구조를 시각화할 수 있는 강력한 기술입니다. 형광 현미경 검사를 위한 샘플을 준비하기 위해 저온 유지 장치 마이크로톰(cryostat microtome)을 사용하여 냉동 조직의 얇은 부분을 절단하는 경우가 많습니다. 이 블로그 게시물에서는 Cryostat 마이크로톰 공급업체로서의 경험을 바탕으로 형광 현미경 검사에 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하는 방법에 대한 몇 가지 통찰력을 공유하겠습니다.
Cryostat Microtome 이해
저온 유지 장치 마이크로톰은 저온에서 냉동 조직의 얇은 부분을 절단하도록 설계된 특수 장비입니다. 이는 절단 블레이드, 시편 홀더 및 온도 조절 챔버로 구성됩니다. 낮은 온도는 조직 구조를 보존하고 형광 분자의 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다.
시중에는 다양한 유형의 저온 유지 장치 마이크로톰이 있습니다. 예를 들어,극저온정밀한 절단 기능을 제공하는 동시에저온 유지 장치 반자동자동화와 사용자 제어 간의 적절한 균형을 제공합니다. 우리의저온 유지 장치 마이크로톰연구원의 다양한 요구를 충족시키기 위해 고급 기능을 결합합니다.
저온 유지 장치 마이크로톰 준비
저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하기 전에 기기를 적절하게 준비하는 것이 중요합니다. 먼저 절단 날과 시편 홀더를 청소하여 잔해물이나 오염 물질을 제거합니다. 철저한 청소를 위해 적합한 세척액과 부드러운 솔을 사용하십시오.
다음으로 저온 유지 장치 챔버의 온도를 설정합니다. 이상적인 온도는 절단되는 조직의 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로 -18°C에서 -25°C 사이의 온도가 대부분의 조직에 적합합니다. 진행하기 전에 저온 유지 장치가 설정 온도에 도달하도록 허용합니다.
조직 샘플 준비
조직 샘플 준비의 품질은 성공적인 형광 현미경 검사에 매우 중요합니다. 적절한 고정액으로 조직을 고정하는 것부터 시작하십시오. 형광현미경의 경우 형광 신호를 잘 보존하기 때문에 파라포름알데히드와 같은 고정제가 일반적으로 사용됩니다.
고정 후 조직을 동결 보호해야 합니다. 이는 동결 중에 얼음 결정 형성을 방지하기 위해 자당과 같은 동결 보호 용액에 조직을 담그는 것을 포함합니다. 그런 다음 조직을 OCT 화합물과 같은 적합한 동결 배지에서 동결시킵니다.
표본 홀더에 조직 장착
조직이 동결되면 표본 홀더에 장착해야 합니다. 냉동된 조직 블록을 검체 홀더에 조심스럽게 놓고 적절한 장착 장치를 사용하여 고정합니다. 정확한 절편을 보장하려면 조직이 중앙에 있고 홀더에 단단히 부착되어 있는지 확인하십시오.
단면화 매개변수 설정
절편 프로세스를 시작하기 전에 저온 유지 장치 마이크로톰에서 절편 매개변수를 설정합니다. 이러한 매개변수에는 단면 두께, 절단 속도 및 전진 속도가 포함됩니다. 단면 두께는 조직 유형과 형광 현미경 실험의 요구 사항에 따라 다릅니다. 대부분의 응용 분야에서는 단면 두께가 5~10마이크로미터가 적합합니다.
절단 속도와 전진 속도는 조직의 경도에 따라 조정되어야 합니다. 부드러운 조직은 더 느린 절단 속도와 더 작은 전진 속도를 요구할 수 있는 반면, 더 단단한 조직은 더 빠른 절단 속도를 견딜 수 있습니다.
조직 절편
매개변수가 설정되면 단면화 프로세스를 시작합니다. 시편 홀더를 절단 날 쪽으로 천천히 전진시킵니다. 칼날이 조직을 절단하면서 얇은 단면이 생성됩니다. 가는 브러시나 섹션 리프터를 사용하여 섹션을 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다.
손상을 방지하려면 섹션을 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 섹션이 슬라이드에 고르게 분포되어 있고 겹치지 않는지 확인하십시오.
섹션의 형광 염색
절편을 만든 후 다음 단계는 형광 염료로 절편을 염색하는 것입니다. 핵 염색을 위한 DAPI, 특정 단백질 라벨링을 위한 Alexa Fluor 염료 등 다양한 응용 분야에 사용할 수 있는 다양한 형광 염료가 있습니다.
제조업체의 지침에 따라 염색 용액을 준비합니다. 적절한 시간 동안 염색 용액에 섹션을 배양합니다. 염색 후에는 섹션을 철저히 씻어서 여분의 염료를 제거하십시오.
스테인드 섹션 장착
섹션이 염색되면 커버슬립에 장착해야 합니다. 형광 염료와 호환되는 적절한 장착 매체를 사용하십시오. 얼룩진 부분에 장착 매체 한 방울을 놓고 커버슬립을 슬라이드 위로 조심스럽게 낮추어 기포가 형성되지 않도록 합니다.
섹션 이미징
마지막으로, 염색된 부분은 형광 현미경 검사를 위한 준비가 되었습니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 초점과 배율을 조정하여 형광 신호를 시각화합니다. 다양한 형광 염료를 감지하려면 적절한 필터를 사용하십시오.
문제 해결 및 팁
- 단면 품질: 절단면이 구겨지거나 찢어진 경우 절단날이 무뎌지거나 손상되었는지 확인하십시오. 고품질의 단면을 생산하려면 날카로운 칼날이 필수적입니다.
- 형광 신호: 형광 신호가 약한 경우 염색 프로토콜을 확인하세요. 염색 시간과 염료 농도가 적절한지 확인하세요. 또한 섹션이 과도하게 세척되지 않았는지 확인하십시오. 이렇게 하면 형광 신호가 감소할 수 있습니다.
- 온도 조절: 절편 공정 전반에 걸쳐 저온 유지 장치 챔버의 온도를 안정적으로 유지합니다. 온도 변화는 섹션의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.
구매 및 상담 문의
형광 현미경 검사에 필요한 저온 유지 장치 마이크로톰 구입에 관심이 있거나 사용에 관해 질문이 있는 경우 언제든지 당사에 문의하세요. 당사의 전문가 팀은 귀하의 연구에 적합한 장비를 찾는 데 도움을 드릴 준비가 되어 있습니다.
참고자료
- 조직학: Michael H. Ross와 Wojciech Pawlina의 텍스트 및 지도책.
- 형광 현미경 검사법: Richard P. Haugland의 원리, 기술 및 응용.